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标题：Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM

发表杂志：EBioMedicine（IF=11.205）

发表时间：202209

研究背景

胶质母细胞瘤（GBM）是具有侵袭性的原发性脑肿瘤类型，通常对目前的治疗具有耐药性，以肿瘤微环境为中心的疗法可能为GBM治疗带来新的希望。因此，迫切需要深入了解肿瘤-基质通讯，以确定有希望的治疗靶点。

研究方案设计

1、收集人、小鼠GBM的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据、RNA-seq数据和空间转录组（Spatial transcriptomics，ST）数据；

2、免疫细胞分选

1）小鼠脾脏T cells：EasySep Mouse T Cell Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19851) ；

2）单核细胞：RPMI-1640 medium (Life Technologies, 11875119)冲洗股骨和胫骨，40μm滤器过滤，EasySep Mouse Monocytes Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19861)分选.；

3）CD11b+F4/80+GPNMB+ macrophages and CD11c+MHCII+ dendritic cells：anti-CD45 (1:200, eBioscience), anti-CD11b (1:200, eBioscience), anti-CD11c(1:200, BioLegend), anti-F4/80 (1:200, BioLegend), anti-MHCII (1:200, eBioscience) and anti-GPNMB (1:100, Invitrogen)。

3、流式分选：小鼠GBM细胞悬液抗体孵育30 mins，anti-CD45 (1:200, eBioscience)、anti-CD3 (1:100, BioLegend)、anti-CD11b (1:200, BioLegend)、anti-CD11c (1:200, BioLegend)、anti-F4/80 (1:200, BioLegend)、anti-MHCII (1:200, eBioscience) 、IgG antibodies对照；

4、免疫荧光：anti-GPNMB (1:50, R&D Systems)、anti-Mac-3 (1:100, BD)、anti-CD3(1:100, Abcam) 。

5、细胞共培养：前神经元型胶质瘤细胞和新鲜分离的CD11b+ F4/80+巨噬细胞，每三天加入新鲜的巨噬细胞，持续的刺激后检测间充质表型的三种主要转录因子的表达（EPAS1、CEBPB、FOSL2）。

数据分析方法

1、scRNA-seq数据处理：Seurat，低质量细胞过滤（a cutoff value of less than 200 total feature RNA and more than 5% mitochondrial RNA）、SCTransform标准化、PCA降维（npcs=30）、细胞类群识别FindNeighbors and FindClusters（resolution=0.8）、差异分析FindAllMarkers function (cutoff:min.pct=0.25 and logfc.threshold=0.25)；

2、ST数据处理：Seurat 4.0，SCTransform标准化、 PCA and UMAP降维聚类（npcs=30）、SpatialFeaturePlot空间可视化；

3、肿瘤拷贝数据变异：inferCNV，过滤expressed less than 10 cells and a median expression below 0.1；

4、细胞轨迹分析：Monocle 2，过滤expression was less than 0.5 and expressed cells were fewer than 200；

5、转录因子活性：SCIENCE，相关性GENIE3 (treeMethod= ”RF”, K=”sqrt”, nTrees?=?1000)

6、细胞通讯：Nichenet（Only the top 15% expressed genes in sender cells were calculated by regulatory potentials and ligand activity was ranked with a cutoff of 0.5 using Pearson test）、CytoTalk（分析T cells、 dendritic cells、Gpnmb-high macrophages、monocytes）

研究思路

研究结果

1、scRNA-seq分析GBM肿瘤异质性图谱

利用Seurat整合分析了来自不同数据集的scRNA-seq数据（GSE103224、GSE138794、GSE139448和GSE131928），共获得来自40例患者的54,534个细胞（图1a）；利用inferCNV分析进一步鉴别肿瘤细胞和正常细胞（图1），与已发表的WES 数据一致；鉴定注释到的恶性细胞包括：MES-like细胞（12.2%，CHI3L1、ADM）、AC-like细胞（36%，MLC1、HOPX）、NPC-like细胞（4.9%，CD24、DCX）和OPC-like细胞（26.4%，PDGFRA、OLIG1），非肿瘤细胞包括：巨噬细胞（8.2%，CD163、CD68）、小胶质细胞（1.5%，CX3CR1、TMEM119）、淋巴细胞（0.7%，CD3D、NKG7）、内皮细胞（1.1%，VWF、PECAM1）、肿瘤相关内皮细胞（0.8%，COL1A2、BGN）、少突胶质细胞（4.3%，PTGDS、MBP）（图1c-d）；GBM患者表现出高水平的瘤内异质性，尤其是肿瘤细胞（图1E-F）；GSEA分析也验证了GBM的不同肿瘤细胞亚型（图1g）。

2、轨迹分析揭示前神经元-间充质亚型转换中的关键转录调节因子

利用细胞轨迹分析，探索GBM不同肿瘤亚型间的分化关系，结果显示拟时间线上主要由NPC-和OPC-like 肿瘤细胞逐渐分化为AC-和MES-like肿瘤细胞，同时有个小分支为AC-like肿瘤细胞，揭示了GBM的可塑性和前神经元型（proneural, PN）到间质型（mesenchymal, MES）的动态过渡（图2a-c）；PN与细胞周期、G2M检查点和神经胶质细胞分化相关的通路显著富集，表明PN具有高度增殖性和可塑性，而MES与上皮-间充质转化（EMT）、缺氧、ECM组织和细胞粘附相关的通路显著富集（图2d）；利用TCGA数据集进行生存分析，结果显示，与PN组相比，具有MES-like转录组特征的患者总生存期较差，而与MES-low组相比，MES-high组预后更差，表明具有间充质特征的GBM患者的生存结局较差（图2e）。Tips：利用TCGA数据库中的临床数据，将单细胞数据中鉴定到关键maker基因或基因集进行生存分析，是探讨临床意义的有效途径。

利用SCENIC分析PN或MES细胞中的关键转录调控网络，结果显示，转录因子E2F1、SOX9、RARA、SOX11和SOX4在OPC和NPC细胞中差异过表达，而 EAPS1、CEBPB、FOSL2、STAT2和EGR1在MES和AC细胞状态中差异过表达，细胞轨迹分析证实了PN-MES转换过程中EPAS1、CEBPB和FOSL2的激活以及SOX4、SOX11的下调（图2k）。以上结果突出了从PN到MES细胞状态的动态转变主要是由关键转录因子驱动的。

3、PN-和MES-GBM的肿瘤免疫微环境解析

利用MES基因特征将患者分为MES-high和MES-low组，发现MES-high组肿瘤微环境中伴有丰富的巨噬细胞、T细胞和内皮细胞浸润（图3a, b）；但T细胞浸润在很多癌种的研究中与患者预后呈正相关，因此利用TCGA数据进一步分析，GBM MES亚型表达更高的T细胞和髓系细胞标志物，并且T细胞与巨噬细胞存在很强的相关性（图3c-d）；对空间scRNA-seq数据进行分析，发现CD8 + T细胞与CD68 +髓系细胞、内皮细胞共定位（图3e），证实了T细胞与髓系细胞之间存在空间上的紧密接触，可能发生在血管微环境中（vascular niches）。Tips：每个实验组增加ST样本，不仅能与单细胞数据互相验证，还能对maker基因和细胞类型进行空间定位，精准锁定有真实空间物理接触的细胞间互作关系。

利用反卷积算法对TCGA数据进一步进行分析，发现T细胞丰度与巨噬细胞、树突状细胞显著相关，这是两个主要的髓系细胞（图3f）；利用流式细胞术，分析小鼠GBM中的免疫细胞，证实了T细胞与CD11b + F480 +肿瘤相关巨噬细胞（TAM）或CD11c + MHCII + DC显著正相关（图3g）。因此，间充质亚型中T细胞比例较高主要是由于巨噬细胞的浸润。

4、源自巨噬细胞的GPNMB有助于PN-MES细胞状态转变

利用NicheNet分析肿瘤微环境中的细胞间信号通讯，鉴定到了多个基质细胞-肿瘤细胞相互调控的配体-受体对，其中预测到巨噬细胞高表达的GPNMB与大多数间充质靶标存在相互作用（图4a），GPNMB是一种跨膜糖蛋白，最初是在肿瘤细胞中发现的，参与肿瘤迁移、侵袭、转移，通过直接抑制T细胞活化来逃避免疫；Tips：基于个性化分析结果，优先筛选TOP基因（显著性、差异倍数、靶标基因数目等），结合研究领域内已有特定功能报道的基因或通路，可以帮助更快锁定目标分子。

HPA和TCGA数据分析结果显示，GPNMB主要在巨噬细胞中表达，并且与巨噬细胞标志物显著正相关，这表明巨噬细胞是GPNMB的主要来源（图4b, c），流式细胞术结果证实了GPNMB主要在巨噬细胞上表达，而不是树突状或肿瘤细胞。Tips：流式细胞术是单细胞测序常见的下游验证方法，可用来分选目标细胞类群、验证细胞比例的变化和新鉴定的maker基因作为特定细胞分选的可行性等。

GPNMB在MES亚型患者中高表达，并且与低级别和高级别胶质瘤的预后不良相关（图4d, e）；推测高表达GPNMB的巨噬细胞可以诱导肿瘤细胞向MES表型转变，进一步利用细胞共培养系统来验证这一假设，结果表明，长期接触巨噬细胞可以诱导肿瘤细胞中间充质转录因子的表达，并且靶向GPNMB的中和抗体治疗可以部分消除这种作用，表明GPNMB是PN-MES状态过渡的重要调节因子（图4f）。

5、小鼠scRNA-seq分析单核细胞分化为Gpnmb-high巨噬细胞

收集小鼠GBM scRNA-seq数据，重点关注在早期（d7）和晚期（d28）GBM小鼠的CD45 +免疫细胞。根据细胞maker基因表达鉴定到了NK cells、Cd8+ T cells、Cd4+ T cells、 B cells、neutrophils、cDC1、cDC2、pDC、mDC、monocytes、TAM、monocytes/TAM、microglia cells（图5a）；与以往的报道类似，巨噬细胞随着肿瘤进展急剧侵入肿瘤部位，而小胶质细胞在肿瘤发展过程中逐渐消失（图5b）；细胞轨迹分析推断出树突状细胞和巨噬细胞起源于单核细胞，并随着肿瘤进展而逐渐分化（图5c）；不同的通路主导了肿瘤浸润T细胞的募集，单核细胞主要表达Cxcl10、Cxcl9、树突状细胞特异性表达Ccl17、Ccl22，而巨噬细胞表达Ccl24，Saa3、Arg1和Gpnmb仅在巨噬细胞中出现(图5d）；在肿瘤发生过程中，Arg1和Gpnmb的表达在巨噬细胞中被强烈诱导（图5e-g），这与人GBM数据集中的发现一致；然而，Gpnmb敲低后CD206（经典M2巨噬细胞标志物）表达不变，提示GPNMB不是M2巨噬细胞极化的驱动因素；免疫荧光染色显示GPNMB+巨噬细胞与T细胞共定位（图5h），表明它们之间存在潜在的相互作用。

6、GPNMB-high巨噬细胞影响DC激活T细胞

利用CytoTalk算法分析GBM中T细胞与APC-like细胞间的相互作用，研究完整的信号转导途径，结果显示，T细胞通过Chemokines、cytokines、co-stimulatory/inhibitory、antigen-presentation通路与单核细胞、Gpnmb-high巨噬细胞、树突状细胞相互作用，并且DC细胞与Gpnmb-high巨噬细胞共享Cxcl16-Cxcr6趋化因子信号与T细胞相互作用。为了验证Gpnmb-high巨噬细胞的调控机制，从GBM肿瘤和正常小鼠中提取F4/80 + GPNMB +巨噬细胞、D11c + DC和骨髓来源的单核细胞，然后与na?ve T细胞共培养（图6e）；实验结果显示，与GPNMB+巨噬细胞和单核细胞相比，CD11c + DC共培养表达更高水平的CD69、IFNγ和GZMB，能更好地诱导T细胞活化（图6f）；T细胞增殖实验检测结果也表明，与GPNMB+巨噬细胞和单核细胞相比，CD11c + DC能显著促进T细胞增殖（图6g）。综合以上结果，确定了关键的GPNMB-high巨噬细胞亚群是GBM细胞间通讯的枢纽，不仅诱导PN-MES肿瘤细胞转化，而且通过与DC竞争而损害T细胞激活。Tips：利用细胞通讯分析筛选潜在细胞间互作的受体-配体对，结合细胞共培养、co-IP和免疫荧光等实验，可以探究目标细胞类型对特定细胞功能的影响及机制。

研究总结

1、本文通过scRNA-seq数据将高度异质性的GBM肿瘤细胞分为MES-like、AC-like，OPC-like和NPC-like亚型；

2、利用细胞轨迹分析和转录调控网络分析预测到由特定TF调节的PN到MES细胞状态转换；

3、利用空间转录组数据、TCGA数据库、细胞通讯分析，锁定到了关键的GPNMB-high巨噬细胞，在PN-MES细胞状态转变中发挥重要作用；

4、通过信号转导分析和细胞共培养研究，进一步揭示了这些源自单核细胞的GPNMB高巨噬细胞亚群可能无效地保留T细胞不被树突状细胞激活，提示未来靶向GPNMB-high巨噬细胞的联合免疫治疗可作为有潜力的治疗策略。

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