如何进行细胞轨迹分析?
目前进行细胞轨迹分析的方法和软件非常之多，大致可以概括为两种方法，一种是以monocle软件为代表的拟时序分析（pseudotime analysis），另一种则是以velocyto /scVelo为主的RNA速度分析（RNA velocity）。
1、拟时序分析
2019年Nature biotechnology的一篇文章A comparison of single-cell trajectory inference methods [1] 就对45种拟时序分析的方法进行了评估，这些软件在性能、可扩展性、稳定性和易用性上存在差异，当然也各有其优缺点。软件推断的细胞分化轨迹主要有7种类型，包括环状（cycle）、线性（linear）、分叉（bifurcation）、多分叉（Multifurcation）、树型（Tree）、多种轨迹并存的连接图（Connected graph），及多种不相连轨迹并存的断开图（disconnected graph）。（图1）
![图1 ?轨迹分析算法评估流程及7种细胞分化轨迹类型[1]](http://datong.tonimischitelli.com/wp-content/uploads/2022/02/640.png)
图1 ?轨迹分析算法评估流程及7种细胞分化轨迹类型[1]
2、RNA速度分析
目前绝大多数软件利用的是细胞的基因表达信息，2018年发表在Nature上的一篇文献RNA velocity of single cells[3]，提出了一个新的概念，即RNA速度（RNA velocity ），利用的是reads到表达的信息，通过分析新转录的、未发生剪接的前体mRNA，与成熟的、发生剪接的mRNA（reads是否比对到内含子）丰度之间的比值，来表征细胞定向的动态信息。scVelo[4]软件可以推断包括转录、剪接和降解在内的”基因特异性速度(gene-specific rates)”，并还原细胞过程中的”潜在时间(latent-time)”，而潜在时间近似为细胞分化的真实时间，同时可以识别调控机制，并系统性的推定驱动基因。scVelo分析流程及代码贴在文章末尾，感兴趣的老师不妨实操看看。
图2 ?scVelo软件分析原理示意图[4]
相较于拟时序分析来说，RNA velocity分析的是细胞在某一时刻的潜在分化方向，可以直接从具有时间向量的结果读取到分化方向，无需基于生物学背景指定分化起点和终点；同时RNA velocity的数据可以与Seurat降维数据兼容，也可以嵌入monocle构建细胞轨迹，这对于联合两种分析策略十分便利，利用RNA velocity分析揭示所有未知的细胞分化关系，然后筛选关注的细胞分化过程进行拟时序分析，挖掘分化过程中的调控机制。
如何应用细胞轨迹分析?
1、细胞分化过程重现
基于单细胞测序分析数据，对其他技术手段获取的已知细胞分化关系进行验证。
2020年Nature Communication发表的Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy[5]，利用RNA速度表征了胶质母细胞瘤的分化过程，证实了胶质母细胞瘤层次结构顶点是肿瘤祖细胞，星形细胞、间充质、少突胶质细胞和神经元癌细胞比肿瘤祖细胞的分化程度更高，并且在每个患者中均可见特定细胞分化方向（图3）。
图 ?3 ?胶质母细胞瘤RNA速度分析[5]
图4 ?人睾丸生殖细胞亚群及分化轨迹鉴定[6]
2、潜在的细胞分化路径挖掘
除了鉴定已知的细胞分化过程，通过细胞轨迹分析也能推断未被报道的、可能的未知细胞分化路径，如神经干细胞发育、肿瘤/疾病微环境中免疫细胞分化过程，甚至挖掘到一些稀少的、常规技术手段很难获得的中间状态细胞。
2021年Nature Communication发表的Single-cell sequencing of immune cells from anticitrullinated peptide antibody positive and negative rheumatoid arthritis[7]，研究首先通过比较两种亚型类风湿性关节炎（RA）患者与健康对照外周血免疫细胞图谱差异，关注到了B细胞类型丰度变化，发现ACPA-RA组IGHG4+ plasma B细胞明显升高，HLA-DRB5+ plasma B细胞明显降低（图5，左图）；随后对B细胞进行拟时序分析探究B细胞亚型分化关系，发现在健康对照和RA患者之间B细胞亚型存在不同的分化路径：在健康对照中na?ve B细胞有两条分化路径，1条是分化为HLA-DRB5+plasma B细胞再分化为plasma B细胞，另1条分化为Mem-unsw B细胞到Mem-sw B细胞；而RA患者中，na?ve B细胞直接分化为IGHG4+ plasma B细胞（图5，右图）。
图5 ?类风湿关节炎患者外周血B细胞分析[7]
图6 ??胶质母细胞瘤干细胞样细胞分化轨迹[8]
3、细胞分化过程调控机制解析
通过细胞轨迹分析，分析处于重要分化节点的关键细胞亚群，寻找随着分化时间呈现特定表达模式的关键基因，解析驱动细胞亚群分化的调控机制。
2021年 Nature发表的Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo[9]，为了探索原肠胚形成过程中外胚层的变化，利用RNA速度分析了外胚层（Epiblast）、外胚层（羊膜/胚胎）（Ectoderm (amniotic/embryonic)）、新生中胚层（Nascent mesoderm）、原条（Primitive Streak），由Epiblast起，发生两个分支，一侧由Primitive Streak发育到Nascent mesoderm，一侧发育到ectoderm（图7，左图）；随后利用拟时分析推断Epiblast分化过程中的基因表达变化，检测到ectoderm marker genes（DLX5、TFAP2A 和GATA3）表达上调，而早期神经诱导marker genes（SOX1、SOX3 和PAX6）和分化的神经元marker genes（TUBB3、OLIG2和NEUROD1）表达极低甚至检测不到，这表明CS7中神经分化尚未开始（图7，右图）。
图7 ?RNA速度分析解析原肠胚分化轨迹[9]
如何进行RNA速度分析?
1、软件安装：
pip?install?-U?scvelo?#需要3.6以上版本python
pip?install?velocyto
2、adata 数据结构：
– adata.X：数据矩阵
– adata.obs：细胞的注释
–?adata.var：基因的注释
– adata.nus：非结构化注释，例如图
– adata.layers：附加层数据，如spliced/unspliced矩阵
3、加载需要的库及一些配置
import?seaborn?as?sns
import?scvelo?as?scv
import?pandas?as?pd
import?scanpy?as?sc
import?numpy?as?np
import?loompy
scv.settings.verbosity?=?3??#?show?errors(0),?warnings(1),?info(2),?hints(3)
scv.settings.presenter_view?=?True??#?set?max?width?size?for?presenter?view
scv.set_figure_params(‘scvelo’)??#?for?beautified?visualization
4、计算获取unspliced/spliced矩阵
##?运行run10x
/software/python3.9.6/bin/velocyto?run10x??????????\
#?相应的repeatmasker的重复序列注释文件（可从USCU中获取）
#?http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables
-m?RMSK
cellranger_results??#?cellranger的输出结果路径
sample_name???????????#?样本名
seurat_GTF??????????????#?用于cellranger定量的基因组注释文件
##?输出结果，在cellranger的结果中会创建单个样本的velocyto文件夹，其中的loom文件即为最终结果
data/SC/Normal1-sc/velocyto:
Normal1-sc.loom
data/SC/Normal2-sc/velocyto:
Normal2-sc.loom
data/SC/Normal3-sc/velocyto:
Normal3-sc.loom
data/SC/Normal4-sc/velocyto:
Normal4-sc.loom
5 、loom文件的读取及合并
#?读取单个样本loom文件
Normal_loom?=?sc.read(‘./Normal1.loom’,?sparse=True,?cache=True)
#?合并同组样本的loom文件
import?loompy
Normal_loom_list?=?[Normal1-sc.loom,
Normal2-sc.loom,
Normal3-sc.loom,
Normal4-sc.loom]
loompy.combine(Normal_loom_list,?output_file?=?‘Normal_combined.loom’)
#?读取
Normal_loom?=?sc.read(‘./Normal_combined.loom’,?sparse=True,?cache=True)
6 ?导入Seurat对象的降维聚类结果
使用scVelo进行分析时需要对数据进行降维聚类，若上游分析的降维聚类注释结果基于Seurat，可以直接将Seurat的降维聚类结果添加到adata对象中，下面方法仅供参考。此外，如果上游分析基于scanpy，则可以直接调用scanpy的降维聚类相关的方法。注：此处并没有进行注释，在实际操作中将 seurat_cluster替换为注释后的信息即可，导入seurat之后的所有调用的方法中的groupby参数设置为 seurat_cluster。
library(Seurat)
library(tidyverse)
seurat_obj@meta.data?%>%?rownames_to_column(var?=?‘barcodes’)?%>%
write.table(‘seurat_meta_df.txt’,?sep?=?‘\t’,?quote?=?F)
seurat_obj@reductions$umap@cell.embeddings?%>%?rownames_to_column(var?=?‘barcodes’)?%>%
write.table(‘seurat_umap.txt’,?sep?=?‘\t’,?quote?=?F)
def?using_seurat_meta_umap(loom_file,?seurat_meta_df,?seurat_umap):
#?读入seurat的meta.data以及umap降维结果
seurat_meta_data_raw?=?pd.read_csv(seurat_meta_df)
seurat_umap_raw?=?pd.read_csv(seurat_umap)
#?loom文件原始的index顺序
anndata_index?=?loom_file.obs.index.values
#?合并
meta_data?=?loom_file.obs.reset_index().?\
merge(seurat_meta_data_raw,
left_on=”CellID”,
right_on=”barcodes”,?how=’left’).?\
set_index(‘CellID’).reindex(anndata_index)
meta_data[‘seurat_clusters’]?=?meta_data[‘seurat_clusters’].?\
apply(lambda?x:?“%d”?%?int(x)?if?~np.isnan(x)?else?x).astype(‘category’)
loom_file.obs?=?meta_data
loom_file?=?loom_file[loom_file.obs.dropna().index,?:]
loom_file.obsm[‘umap’]?=?seurat_umap_raw.set_index(‘barcodes’).?\
reindex(loom_file.obs.index).to_numpy().astype(‘float64’)
return?loom_file
Normal_loom?=?using_seurat_meta_umap(Normal_loom,
‘seurat_meta_df.txt’,
‘seurat_umap.txt’)
#?查看是否替换成功，与seurat结果进行比较
sc.pl.umap(Normal_loom,?color=’seurat_clusters’)
分析结果展示
拼接/未拼接计数的比例，通常有 10%-25% 的未拼接分子包含内含子序列。
scv.pl.proportions(Normal_loom,?groupby=’seurat_clusters’)
RNA-速度：速度是基因表达空间中的向量，代表单个细胞运动的方向和速度。速度是通过模拟剪接动力学的转录动力学获得的，对于每个基因，拟合了成熟（未剪接）和成熟（剪接）mRNA?计数的稳态比率，这构成了恒定的转录状态。正速度表明基因被上调，这种情况发生在该基因未剪接?mRNA?丰度高于预期的稳定状态的细胞中。相反，负速度表明基因被下调。
#?预处理
scv.pp.filter_genes(Normal_loom,?min_shared_counts=20)
scv.pp.normalize_per_cell(Normal_loom)
scv.pp.filter_genes_dispersion(Normal_loom,?n_top_genes=2000)
scv.pp.log1p(Normal_loom)
scv.pp.filter_and_normalize(Normal_loom,
min_shared_counts=20,
n_top_genes=2000)
#?运行scVelo动态模型，如果算力不够可以考虑静态或者随机方法
scv.tl.recover_dynamics(Normal_loom,?n_jobs=30)
scv.tl.velocity(Normal_loom,?mode=’dynamical’)
scv.tl.velocity_graph(Normal_loom,?n_jobs=n_jobs)
#?保存计算结果
Normal_loom.write(‘Normal_dy_model.h5ad’,?compression=’gzip’)
scv.pl.velocity_embedding_stream(Normal_loom,
basis=’umap’,
color=’seurat_clusters’)
scv.pl.velocity_embedding(Normal_loom,
arrow_length=3,
arrow_size=2,
show=False,
color=’seurat_clusters’)
潜伏时间：动力学模型描述了细胞过程的潜伏时间（这个潜伏时间代表细胞的内部时钟，并近似于细胞在分化时经历的真实时间，仅基于其转录动力学。）
scv.tl.latent_time(Normal_loom)
scv.pl.scatter(Normal_loom,?color=’latent_time’,
color_map=’gnuplot’,?size=80,?show=False)
驱动基因：显示出明显的动态行为，并通过动态模型中的高可能性特征系统地检测到。
top_genes?=?Normal_loom.var[‘fit_likelihood’].?\
sort_values(ascending=False).index[:300]
scv.pl.heatmap(Normal_loom,
var_names=top_genes,?sortby=’latent_time’,
col_color=’seurat_clusters’,?n_convolve=100)
scv.pl.scatter(Normal_loom,?basis=top_genes[:15],
ncols=5,?frameon=False,
color=’seurat_clusters’)
基于RNA-速度的PAGA分析：PAGA提供了轨迹推断构图的方法，其中加权边对应于两个集群之间的连接。在这里，PAGA通过速度推断的方向性进行了扩展。
scv.tl.paga(Normal_loom,?groups=’seurat_clusters’)
scv.pl.paga(Normal_loom,?basis=’umap’,
size=50,?alpha=.1,
min_edge_width=2,?node_size_scale=1.5)
参考文献：
京公网安备 11011302003368号