多糖多酚样本RNA难提取？真有那么难吗？ |

久久产久射久精国久品在线看_免费试看30分钟保湿套装_伊犁直飞2025直达入口

发布于 2021年12月22日

1.多糖多酚中的RNA为什么难提取？

从多糖多酚植物样本中，如何提取到质量较好的RNA，是许多科研人员最头疼的事情，因为多糖多酚会降低RNA提取纯度&浓度。常见的水果如苹果、柑橘、草莓、树莓、葡萄；常见的农作物如马铃薯、烟草、棉花等；中草药如半夏、石斛、灵芝等，都含有大量的多糖多酚。那么为什么多糖多酚植物RNA较难提取呢？具体原因有3点：

1.RNA为单链结构，易降解，且含有2’-OH基团，易发生氧化还原反应，分子结构不稳定。

2.遍布各处的RNase（RNA水解酶）能催化RNA降解，且酶活高不易清除。

3.部分植物样本富含多糖、多酚，或含有某些尚无法确定的次级代谢产物,干扰RNA的质量。

多糖：其理化性质与RNA相似，在去除多糖过程中会裹挟大量的RNA，导致RNA的得率降低；同时在RNA沉淀过程中，多糖也会和RNA形成凝胶沉淀，导致RNA纯度过低；多糖还会影响一些酶的活性，降低建库成功率。

酚类：细胞裂解后，酚类化合物遇空气极易氧化成醌类。与RNA不可逆结合，从而影响其纯度。越成熟的组织酚类含量越高，幼嫩组织提取难度较小。

[注意]：在裂解液中加入抗氧化剂，可抑制RNase酶活性，并减轻酚类物质的影响。

次级代谢产物：成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，易与RNA结合，降低RNA提取的质量。

2.RNA提取方法

目前市场上常见的提取RNA的方法，包括Trizol法、SDS-苯酚法、试剂盒法等。这些方法各有优缺点，具体如下：

（一）TRIzol法

TRIzol主要成分：苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。异硫氰酸胍是强有力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，释放出核酸。

优点：操作简单、RNA提取完整性好、适用于一些次生代谢物含量少的植物组织。

缺点：苯酚不能完全抑制RNAse活性，完成RNA部分损失。

（二）SDS-苯酚法

SDS和苯酚能够使蛋白质变性、抑制内源性RNase的活性，同时裂解细胞膜，释放出所需要的RNA。而且苯酚可以将溶液中蛋白质、多糖、DNA 分层到有机相中，而RNA则留在上清溶液中。

优点：操作简单，省时省力。

缺点：提取过程中，无法清除大量的多糖多酚，导致提取的RNA纯度降低，无法保证后续建库测序实验的进行。

（三）试剂盒法

目前市场上有许多专门用于多糖多酚植物RNA提取试剂盒，试剂盒中的裂解液可以裂解植物样本，盐酸胍抑制RNase的活性；β-巯基乙醇抑制RNase的活性同时使蛋白变性，最后通过离心柱上的吸附膜，特异性吸附RNA。

优点：操作简便、快捷、不需要加入氯仿等有机溶剂；RNA纯度高，适用于下游定量、建库、测序等实验。

缺点：必须是新鲜或者未反复冻融的植物样本；提取操作不当，可能会堵塞滤膜。

3.RNA质量检测

提取完RNA后，都要进行一系列的质量验证，质量合格的RNA，才能用于后续的建库、测序、荧光定量等实验。一般需要对RNA的浓度、纯度、完整性进行检测，具体检测方法&标准如下：

1.RNA浓度&纯度检测：一般需要通过紫外分光光度计，检测RNA在260 nm的吸光度。纯RNA：OD260/OD280≈2.0

表1：通过紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度

2.完整性检测：可以通过凝胶电泳法和检测RIN值，来判断RNA的完整性。凝胶电泳法真核生物RNA进行跑胶后，有三个亮度不一样的条带，分别是28S、18S、5S。一般28S条带最亮，18S次之，5S条带最弱甚至看不见。若28S条带的亮度大概是18S条带的两倍或者以上，这种情况RNA的质量是很好的。如下图所示

图1：凝胶电泳检测RNA完整性（图片来源于网络）。

3.Agilent 2100仪器检测RIN值

RNA Integrity Number （RIN）值大小反映了RNA的完整性，一般认为RIN值范围为6.3-10.0，就说明RNA完整。RIN值越接近10，表明RNA完整性越好，反之完整性越（特殊样品需结合基线综合评估）。Agilent 2100仪器不仅可以检测RIN值，还可以得到RNA的浓度和28S/18S比值（原核生物为23S/16S）。