近日，兰州大学基础医学院学者发表了有关畸形精子症男性不育相关研究，该研究中外显子测序由百迈客生物科技有限公司完成，详情如下：

研究方法

1. 形态学分析：通过透射电子显微镜观察精子形态异常

2. 全外显子组测序鉴定候选致病基因：先证者所在近亲家系（4例，先证者、先证者弟弟及其父母），突变位点筛选及保守性分析

3. 突变位点验证：sanger测序验证筛选后的候选突变位点

4. 预测突变后蛋白结构变化：Swiss-Model蛋白结构建模及可视化

5. 大量散发样本验证：124名患有畸形精子症的散发性不育男性患者和200名正常生育的男性对照中进行单个基因靶向测序，筛查散发病例中的突变

研究结果

1、患者表型–形态学分析

本研究中涉及的为甘肃省回族一个近亲结婚家系，其中两兄弟都没有孩子，并且患有生育障碍。许多以前的精液分析显示出严重的畸形精子症。两兄弟以前没有重大疾病的记录，检查显示正常的男性血清激素水平，正常的46,XY 核型和Y染色体微缺失。

形态学分析显示严重的完全畸形精子症，主要的异常是严重的无定形头，具有空泡和过剩的残留细胞质（图1F）。来自两兄弟的精子在头部出现畸形（图1G和H）。精子呈现较大的无定形头和腔隙染色质缺陷（空泡），具有丰富的残留细胞质。

2、WES鉴定FBXO43 C1991T纯合突变

对两兄弟及其父母进行了全外显子组测序WES，平均覆盖深度为120×，目标区域覆盖度为99.87％。排除在任何变异数据库中MAF>0.05的变异，错义突变、无义突变、移码突变和剪接位点突变等优先保留。此外，SIFT、PolyPhen-2和Mutation Taster等同时预测为具有潜在有害性的变异也被保留用于进一步评估。

由于父母为近亲结婚，首先考虑常染色体隐性遗传模式，确定了2个具有功能丧失突变或潜在有害的错义突变位点。结合基因功能分析等条件过滤后，锁定了一个新的非同义突变FBXO43（C1991T，p.G664D）。通过Sanger测序，证实了2个兄弟存在FBXO43中的C1991T纯合突变。先证者的父母携带杂合突变。

3、FBXO43纯合突变的保守性和结构功能分析

FBXO43基因C1991T（G664D）纯合突变位于5号外显子（图2A）。FBXO43蛋白质包括?F-box和C-端的ZBR（锌结合区）（http://www.uniprot.org/uniprot/Q4G163）。残基G664D位于FBXO43蛋白的C端ZBR中（图2B），残基G664在Euteleostomi（真硬骨动物）中高度保守（图2C）。非同义突变G664D不存在于1000G以及ExAC数据库中。此外，SIFT、PolyPhen-2和Mutation Taster预测G664D突变可导致蛋白功能变化（有害）。

（注：该图中除C1991T（G664D）外，其他突变为在散发样本中发现的FBXO43基因突变）

FBXO43（c.1991C>T）非同义突变导致FBXO43蛋白664残基从非极性氨基酸（Gly甘氨酸）转变为带负电荷的氨基酸（Asp天冬氨酸）（G664D）。蛋白质二级结构通过in silico结构模型预测，与野生型相比，具有2个明显缩短的β-折叠（残基654-668）、额外产生的α-螺旋（残基610-613）和明显变化的loop（残基583-618）。

4、散发样本FBXO43突变筛查

为了评估更广泛人群中FBXO43的突变，对散发不孕患者和未受累对照进行了FBXO43基因突变筛查。所有散发不孕的患者均为甘肃省汉族人。主要的异常是无定形精子头，具有可变比例的空泡和过剩的残留细胞质。其他精液参数因不同患者而异，包括不同的精子浓度水平（41.61±32.48×106/ml）和不同精子活力（45.397％±22.83％）。

在124名散发患者中有4名（3.2％）携带FBXO43杂合突变。这4名患者均出现不孕和畸形精子症。此外，这些突变也不存在于1000 Genomes Project和ExAC数据库中（表1）。残基E594、I250、G149和E98在Euteleostomi（真硬骨动物）中也是保守的（图2C）。

为了排除所鉴定的突变在研究群体中是常见突变的可能性，对来自中国200个可育个体的FBXO43外显子进行了突变筛查。进行精液分析和生育有后代的200名可育人群均为甘肃省汉族人。然而，在200个对照个体中没有发现任何致病性FBXO43突变。

小结

作者在一个中国近亲家庭的2个不育兄弟中发现了FBXO43基因突变。临床筛查和遗传分析结果支持FBXO43突变可能与以畸形精子症为特征的男性不育相关。在临床ICSI（Intracytoplasmic sperm injection，即卵胞浆内单精子显微注射技术）中，精子的质量基于形态学标准，并且在一些不育个体中重复治疗失败的确切原因在很大程度上是未知的。因此，对畸形精子症的遗传基础的研究可能揭示精子发育背后的其他基因和相应的机制。本研究研究结果为男性不育的分子诊断提供了候选基因，并扩展了对FBXO43突变的致病作用的认识，需要进一步的研究来探索FBXO43的功能并深入了解畸形精子症可能的遗传基础。

参考文献：

MA, Ying, et al. A novel homozygous FBXO43 mutation associated with male infertility and teratozoospermia in a consanguineous Chinese family. Fertility and sterility, 2019.

 

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