高通量测序技术的飞速发展，使得基因数据量直线飙升，随之而来的就是对基因功能研究的新挑战。做完测序我们得到感兴趣的基因或ncRNA，并对它们的功能、作用机制做生信方面的分析后，如果我们要深入研究下去，就需要依靠分子实验手段做筛选到的感兴趣基因或ncRNA的功能及作用机制方面的研究。
基因或ncRNA研究组成模块本质上是差不多的，都是由生物学问题、分子（基因或ncRNA）、功能和机制、通路组成，而每个层面又有针对于不同情况的具体的实验技术，而文章的千变万化就在于这些模块之间、这些技术之间的不同组合。

01.表达量检测、定位、全长鉴定：缩小范围，找到重点

对于很多研究，第一步一般都会去验证从测序结果中筛选到的基因或ncRNA，主要验证要研究的基因或ncRNA的表达量（RT-qPCR、northern、WB）、
表达在组织或亚细胞间的特异性（RT-qPCR、northern、FISH、GFP融合蛋白、核质分离）、序列的准确性及是否有新的可变剪切（5’/3’RACE）等。

这一步可以缩小研究的范围，有时候也会发现新的兴趣点，比如这篇Journal of Experimental Botany的文章中，作者发现了slctr4基因的一个新的可变剪切命名为slctr4vs3，并且在slctr4的3个可变剪切中只有slctr4sv3与sly-mir-1917呈负相关
（负相关是miRNA调控靶基因最常见的方式，说明这个miRNA很可能调控这个基因），在后期的Y2H实验和BiFC实验中发现slctr4sv3与SlEIN2互作，这样就打通了miRNA-1917-slctr4-SlEIN2这样一条通路。

02.基因功能研究

做完这部分基础的验证后，就需要验证基因或ncRNA的功能，功能的验证主要分两类：获得性研究和缺失性研究，获得性研究即通过VIGS或遗传转化/转基因让目的基因过表达，缺失性研究即用RNAi、CRISPR/Cas9等技术让目的基因沉默或突变为无功能基因。通过这部分研究可以验证目的基因的功能。

比如这篇发表在Developmental Cell的章中对lncRNA COLDWRAP的RNAi敲除品系表现出减少的春化反应，将COLDWRAP转入COLDWRAP突变体后，COLDWRAP表达恢复了春化反应。

03.作用机制研究：文章容易出彩的地方

目的基因或ncRNA研究完，进一步就需要探讨目的基因是如何发挥作用的，比如上述lncRNA COLDWRAP，是通过什么方式对春化作用产生影响的呢？这就需要研究COLDWRAP的作用机制，很多高分文章都是这部分的研究非常精彩！
比如，下面这篇发表在Plant Cell上的文章，作用机制部分研究就比较精彩。
作者先在体外，用酵母双杂交鉴定FRI蛋白互作的蛋白，发现FRI的N端区域与其与LRB1和LRB2的相互作用是重要的，FRI的C端区域和CUL3A的N端区域是它们相互作用所必需的。之后用GST pull-down验证酵母双杂交结果。

之后在体内，用BiFC在体内验证定位、酵母双杂交、GST pull-down结果，用co-IP分析瞬时表达FRI和CUL3A再次验证相互作用。

最后通过体外降解试验发现FRI通过泛素-26蛋白酶体途径降解，表明CUL3A和LRB1 / 2是FRI降解所必需的，FRI降解是CUL3A，LRB1 / 2和蛋白酶体依赖性过程介导。最终得出蛋白酶体介导的FRI降解调节拟南芥春化过程中开花的结论。

?04.把生物学故事串起来

好的研究最终能依靠转录因子、信号通路等把研究结果串起来，系统地解释一个生物学问题。

比如上面谈到的Plant Cell的文章，作者发现转录因子WRKY34的转录迅速被冷应激诱导，之后构建pCUL3A-LUC载体和W-box区域突变pCUL3A-LUC载体，与WRKY34共注射入烟草和拟南芥叶原生质体，来验证WRKY34以预测的W-box与CUL3A启动子结合以增加其CUL3A转录，而CUL3A又介导FRI降解调节拟南芥春化过程中的开花，从而把生物学故事由冷诱导—WRKY34转录—CUL3A转录—FRI降解—拟南芥春化过程中的开花这样一条线串起来。

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