杂志期刊：Scientific Reports
发表时间：2017年9月12日（online）

1.研究背景
植物类病变(lesion mimic, LM)又称类病斑，是指在没有受到任何病原菌侵染的条件下，植物自发产生坏死斑点。这种局部细胞的坏死属于细胞程序化死亡（PCD），细胞程序化死亡在植物生长发育过程中广泛存在，特别是受到生物或非生物胁迫，当受到不相容的病原菌感染时，植物可以在受感染的部位启动某种形式的PCD，以限制病原体的传播，这是一种先天性的免疫反应，称为超敏反应（HR）。HR是植物细胞为限制病原菌生长而快速死亡的一种方式，其诱导的细胞死亡可以激发邻近组织的防卫反应(defense response)和植株的系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)。

水稻与玉米类病变突变体表型

研究HR信号转导最有效的方式就是利用一类表现型与病原菌侵染后HR症状类似的突变体开展工作，这些突变体称为类病变突变体（lesion mimic mutation，LMM）。植物类病斑突变体根据其表型特征及PCD发生是否可控，分为起始型突变体和扩散型突变体。前者是指在无病原菌侵染下，植物体自发形成一些位置和大小相对稳定的斑点；后者是指斑点形成后易扩散，且这种类型的斑点之间没有明显的界限。研究发现，类病变发生的机制相当复杂，主要受抗病、调控死亡及代谢相关基因的调控。其次，活性氧途径、水杨酸、茉莉酸、乙烯以及一氧化氮在植物抗病和超敏反应中也发挥了重要作用。

2.实验材料
转录组材料为lmd、oe21、NT，lmd突变体是从BpGH3.5转基因株系中分离出；oe21株系是正常的BpGH3.5转基因株系；对照材料是非转基因的NT。
测序平台：百迈客Illumina HiSeq 2500，PE125

3.结果解读
1、lmd突变体表型鉴定
作者在研究BpGH3.5在桦树中的功能时偶然获得了lmd突变体。构建的21株OE-GH3.5株系中，唯独lmd叶片表现出坏死斑点并伴有早衰的现象。这很明显是一种病变的表现，当这种情况出现，很显然我们要思考两个问题：
一、lmd独特的表型显然不是过量表达BpGH3.5导致的，那么引起lmd与其他20株BpGH3.5超表达株系表型差异的原因是什么？
二、是否是感染某种病原菌导致的lmd出现坏死斑点的表型。这两个问题的连接点就在于表型，但解决的方式不一样。
一问题解决的是lmd内部矛盾；二问题探讨的是外部因素。解决好这两个问题，也就揭开了lmd身上的神秘面纱。在解决这个问题之前，首先要明确lmd展现出的phenotype外部因素是什么？植物表现出坏死斑点，最容易联想到病菌，但在木本植物培养基上的lmd幼苗同样表现出了这种表型，这说明引起lmd表型的原因并不是病原菌而是一种自发的现象，作者做出判断lmd应该是一种lesion mimic mutants（LMM，类病变突变体）。而关于lmd的内部矛盾也很好理解，超表达株系中某一株系表现出与众不同的表型，很容易让人想到是否是插入位点影响了某个重要功能基因。作者接下来就通过一系列实验来求证这些观点。

图1：Lmd生长相对迟缓

图2：lmd叶片

图3：立体显微镜下不同叶龄的叶片病变部位

类病变突变体通常会表现出自发性的细胞程序性死亡（PCD），作者通过伊文思蓝染色比较了lmd与NT、oe21的细胞死亡情况（图4）；丙二醛含量检测间接反映了lmd细胞损坏程度也更高（图5）；

图4：lmd叶片染色以及与NT、oe21的对比分析

图5：MDA含量测定

2、细胞结构变化揭示lmd突变体表型
细胞程序性死亡经常伴随着细胞结构的变化，光学显微镜显示lmd突变体的死细胞聚集在一起，而周围的细胞是正常结构的，死细胞并没有明显扩散痕迹（图6），表明lmd是起始型的类病变突变体。接下来作者用透射电镜观察了lmd叶片细胞的超微结构。与oe21和NT相比，在lmd突变体中观察到更多的死细胞，一些细胞产生吞噬作用，细胞器消失，只留下一个空细胞壁（图7），这一结果表明了lmd突变体中发生了典型的细胞程序性死亡。桦树叶片上有许多叶腺，在叶片成熟后会退化。由于lmd表现出叶片早衰现象，作者用扫描电镜扫描叶片表面，以观察lmd是否有变化。在第三个叶片上，发现lmd叶片上的叶腺体比NT和oe21叶片少（图8）。SEM观察表明，lmd确实发生了早衰。

图6:切片显示病变部位发生细胞死亡

图7：投射电镜观察细胞超微结构

图8：叶腺体结构观察

3、转录组揭示lmd体内的分子水平变化
为了深入了解lmd体内的分子水平变化，作者进行了转录组测序。对差异基因进行分析发现了许多与致病相关的基因，如WRKY、谷胱甘肽-转移酶(GST)、乙烯反应因子(ERF)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase)，这些都已经被研究证实与防御反应相关。GO富集分析显示，参与催化活性、抗氧化活性、免疫系统过程和刺激响应的差异基因发生了显著富集（图9）。

图9：GO富集分析结果

4、lmd体内过氧化物积累
许多LMM坏死病变的形成都与ROS相关。为了确定lmd的程序性细胞死亡是否伴随着活性氧的产生，作者进行了DAB染色和DCFH-DA染色，结果显示lmd体内积累了较多的过氧化物（图10）。

图10：DAB染色与DCFH-DA染色结果

5、lmd突变体对Alternaria alternata（烟草赤星病菌）具有较强抗性
研究发现类病变突变体增强了对病原菌的抗性，为了测试lmd突变体是否对Alternaria alternata有抗性，作者将孢子悬浮液喷洒在NT、oe21和lmd幼苗上。7天之后，NT和oe21感染严重，出现了几片枯萎叶片，而在lmd突变体中观察到的枯萎叶片很少，尽管其叶片上有许多病变（图11）。喷施17天后，NT和oe21的发病率均在90%以上，但lmd仍未出现感染叶片。lmd的发病时间出现在喷洒后22天，而此时，lmd的发病率为45.55%，但NT和oe21的发病率均为100%（图12）。

图11：感染Alternaria alternata后NT、oe21、lmd的表型

图12：发病率统计结果

6、揭开lmd的庐山真面目
前面提到过，作者构建了21个BpGH3.5超表达株系，由于其他20个BpGH3.5株系没有显示与lmd相似的表型，因此lmd的表型不是BpGH3.5过表达的结果，而是与T-DNA插入有关。作者通过基因组重测序与TAIL-PCR证实lmd基因组上有两个T-DNA插入位点，其中一个插入位点位于BpEIL1启动子区域，导致BpEIL1表达水平显著下降，这可能是导致lmd出现类病变表型的主要原因。

创新点
类病变突变体在水稻、玉米、拟南芥等植物中研究较多，但在木本植物中却鲜有报道，本研究通过转录组手段研究了桦树lmd突变体产生类病变表型的分子机制，为进一步研究木本植物类病变基因提供了基础。

读后感
故事到这就结束了，读完这篇文章后，小编最大的感想就是“无心插柳柳成荫”，偶然获得的超表达株系表现出独特的表型，并借用转录组与生理实验的手段，作者解开了围绕在lmd身上的神秘面纱。突然想起了一句话，千万别担心生物学没有科研方向，随便一个坑就能给你一条路！年关将至，各位奋斗在科研路上的大咖们，您的年终汇报准备的咋样了？

参考文献
Li R, Chen S, Liu G, Han R, Jiang J. Characterization and Identification of a woody lesion mimic mutant lmd, showing defence response and resistance to Alternaria alternate in birch. Sci Rep. 2017 Sep 12;7(1)

杨瑞丨文案
吴戈宇 | 审核

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