依赖：

• python： 版本9，安装cv2模块（4.0以上版本），Cython，numpy，seaborn模块
• Minimap2
• Samtools：版本2及以上

依赖的软件需要使用export添加到环境变量中，以实现流程的调用。

安装：在流程目录下运行以下命令

pip install ./bmk-ocean-stars

2. 输入数据准备

• 测序数据：ONT测序fastq数据（支持.gz格式）
• 参考基因组数据：基因组fa序列文件，gtf文件（包含gene、exon）
• 荧光解码文件及HE图片文件

3. 配置文件编写

配置文件：

## 测序数据

FQ /path/to/ont-reads.fastq

## 荧光解码文件

FLU /path/to/flu_info.txt

## 参考基因组序列、gtf文件

Genome /path/to/ref/genome/fasta

GTF /path/to/ref/gene/gtf

## HE图片文件

HE /path/to/HE.tif

## 输出目录及输出前缀

OUTDIR /path/to/result/dir/

PREFIX outfile-prefix

### 程序运行线程数

Threads 8

Link1 TACGT

4. 流程运行

流程说明：

流程分为4个步骤，如下所示：

步骤1：运行GenomeMap，将ONT reads与参考基因组比对。

步骤2：运行MatrixMake，识别barcode、UMI并生成表达矩阵文件。

步骤3：运行AllheStat，处理HE图片。

步骤4：运行WebReport，得到网页版报告。

流程参数：

-c config.txt 数据配置文件

-s 步骤选择，0为运行1-4所有步骤，也可选择个别步骤单独运行，多个步骤中间使用“，”分割。

参考命令：

./BSTMatrixONT -c config.txt -s 0

./BSTMatrixONT -c config.txt -s 1,2,3,4

./BSTMatrixONT -c config.txt -s 1,2

5. 结果文件说明

目录结构及结果说明：

outdir/

├── 01.GenomeMap 步骤1运行结果目录

│ ├── HXFA2-3.sort.bam 基因组比对bam文件

│ ├── HXFA2-3.sort.bam.bai

│ └── mapping.sh

├── 02.MatrixMake 步骤2运行结果目录

│ ├── bam

│ ├── bc_umi_read.tsv barcode-umi-reads数文件

│ ├── bc_umi_read.tsv.stat

│ ├── cache_raw_expression.pkl

│ ├── filtered_feature_bc_matrix

│ ├── final_matrix 过滤后的matrix文件

│ ├── flu_recognition barcode芯片位置识别目录

│ ├── HXFA2-3.bc_gene_umi.bc_stat barcode检测结果统计文件

│ ├── HXFA2-3.bc_gene_umi.map_stat 比对类型结果统计文件

│ ├── HXFA2-3.bc_gene_umi.stat barcode-gene-umi对应文件

│ ├── raw_feature_bc_matrix

│ ├── reads_cumi.tsv barcode-gene-umi数文件

│ ├── reads_info.tsv reads相关信息文件

│ └── web_summary.html 网页版统计结果文件

├── 03.AllheStat 步骤3运行结果目录

│ ├── allhe

│ ├── all_level_stat.txt 不同水平的spots统计

│ ├── BSTViewer_project BSTViewer软件输入数据

│ ├── heAuto_level_matrix

│ ├── level_matrix

│ ├── stat.txt

│ └── umi_plot umi count图片统计图目录

├── 04.WebReport 步骤4运行结果目录

│ ├── prefix.filelist

│ ├── index.html 网页版报告html文件

│ └── src 网页版报告src目录

└── prefix 收集的基因表达矩阵等文件目录

├── barcode_pos.tsv barcode类型对应的芯片位置文件

├── barcode.tsv 芯片对应的barcode类型文件

├── bc_gene_umi.stat.gz barcode-gene-umi对应文件

├── bc_umi_read.tsv.gz barcode-umi-reads数文件

├── features.tsv features.tsv文件

└── matrix.tsv 基因表达矩阵文件