研究背景

大白菜是一种重要的结叶蔬菜作物。在抽穗期，叶片内外表现出明显的形态分化。然而，这种复杂的叶片形态分化的遗传控制仍不清楚。

研究目的

在此，作者研究了抽穗期连续的头叶从内到外的转录组谱，通过在24个不同的叶片组织中展示了全基因组基因表达的序列-空间剖面，确定了可能在叶片抽穗中发挥重要作用的关键过渡头叶片，为叶状头部的形成提供新见解。

材料方法

在温室盆栽大白菜，使用11周大的植物进行取样。随机选择两个正常生长的大白菜。从外叶到内叶的所有头叶（叶长>2cm）按顺序分离收集，而带有茎尖分生组织(SAM）的幼叶和小内叶（叶长<2cm）不分离，按顺序收集。从每个大白菜头部共得到30片叶子。从内到外，每3片形态相似、大小相近的叶子为一叶轮，共得到10叶轮叶。

从每轮叶片中选取一片叶子，命名为L1-L10，选择SAM、L1、L2、L3、L5、L7和L9进行转录组分析。对于RNA-seq，L2被分为两部分，叶柄(L2R2）和叶片(L2R1），对于L3、L5、L7和L9，则分为五个区域，包括顶部(R1）、外缘(R2）、叶片的中部区域(R3）、叶柄的顶部(R4）和中部(R5）区域进行采样。对来自两个生物学重复（两个叶头）共计48个样品用Illumina平台进行转录组测序。

图1. 跨越11个叶子层的叶子的代表性图片

研究结果

1、转录组测序

对48个样本进行转录组测序，共产生7.43×108高质量cleanreads，皮尔逊相关系数为0.92-0.99，所有生物学重复都高度相关。将cleanread与大白菜参考基因组进行比对，计算基因表达量TPM值，共鉴定出27,876个基因。其中，75.08%的基因在所有样品中都有表达。

主成分分析(PCA）显示沿主成分(PC）1和2有明显的分离。PC1根据与SAM的距离将叶片样本分开，而PC2将叶片和叶柄组织分开。层次聚类分析将样本分为五类，与叶子形态分化一致。SAM和L1的样本形成内叶1(IL1）最接近茎尖的组织。内叶2的叶片（IL2B）和内叶2的叶柄（IL2P）代表L2-L5的叶片和叶柄组织，而外叶（OLB）和外叶柄（OLP）代表L2-L5的叶片和叶柄组织外叶（L7和L9），与叶子形态分化一致。

图2. 抽穗期不同叶层大白菜叶片的转录组分析

2、差异表达基因分析

作者在全基因组水平上鉴定了不同叶片中的差异表达基因（DEG），以探索叶片之间的多样性和潜在功能。通过分析，共发现9,133DEG，k-means聚类将差异基因分为14个共表达簇(CEC1-CEC14），这些CEC与图1中的5个聚类簇紧密相关。IL1中DEGs的高表达水平以CEC1和2为代表。CEC1在SAM中高度表达，并以与分生组织发育、组织发育和近轴/远轴极性相关的基因为代表。CEC2在SAM和L1高表达，包含与细胞分裂、细胞增殖、细胞生长和生长素生物合成过程相关的基因。IL2B中DEG的高表达水平以CEC4-6为代表。CEC4、5和6均富集于有机酸代谢过程、淀粉代谢过程、质体组织和硫苷代谢、光合光反应等过程。IL2P中DEGs的高表达以CEC9为代表。CEC9富含植物细胞壁相关过程，包括壁组织或生物发生，以及果胶代谢过程。OLB中DEGs以CEC7和8为代表。CEC7在L7叶片中高表达，并以与蛋白质修饰过程、蛋白质磷酸化和蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性相关的基因为代表。这些结果反映L7具有明显的信号转导和基因调控特征。CEC8在L9叶片中高表达，含有一组与叶绿素分解代谢过程、细胞分解代谢过程、防御反应调节、果糖反应和脱落酸激活信号通路相关的基因。OLP中DEG的高表达水平以CEC11和12为代表。CEC11中的基因在L7-L9的叶柄中高度表达，在任何基因本体(GO）术语中均未富集。CEC12中的基因在L9的叶柄中高度表达。这些基因可能主要参与脱落酸激活的信号通路、茉莉酸（JA）代谢过程、JA反应、防御反应、生物刺激反应、水杨酸反应和外部刺激反应。这些结果表明，L9可能在保护多叶头部免受外部损害方面发挥作用。

图3.差异基因在不同叶子中的表达谱

3、叶片发育相关基因的表达揭示叶球形成中的关键过渡叶

作者鉴定了细胞增殖相关基因和细胞扩张相关基因。结果表明，大多数细胞增殖基因在IL1HLs中达到峰值，包括SAM和L1，但在IL2HLs和外HLs中迅速下调(图3A），表明细胞增殖基因在不断生长的内叶的起始过程中发挥重要作用。与细胞增殖基因不同，大部分细胞扩张基因在IL2HLs和外HLs的叶片区域高表达，且表达模式更为多样，分为4个簇(图3A）。此外，大部分细胞扩张基因在IL2HLs和外层HLs之间表现出不同的表达模式，导致L7细胞分裂和细胞扩张调控的变化明显高于IL2HLs和外层叶(图3B）。

图4. 细胞增殖和细胞扩增基因的表达模式

大白菜HLs的弯曲通常被认为是由叶片正轴和背轴之间的不对称细胞生长引起的。通过分析ad-ab极性基因的表达模式，以探究ad-ab极性基因在头叶曲率中的作用。结果表明，与内部HL相比，大多数ad-ab极性基因在外部HL中显示出显着不同的表达模式。

图5.?ad-ab极性基因的表达谱。

通过形态学观察、PCA和聚类分析，以及与细胞分裂/扩张和ad-ab极性相关的基因表达，L7位于内叶和外叶之间的边界。作者通过主成分分析和聚类将L7分类为外叶组，最终确定L7是显示三种模式的过渡状态。此外，作者进一步分析了HLs中可溶性糖的积累和相关基因的表达特征，进一步证实L7是叶状头部发育的关键过渡叶。

4、加权基因共表达网络分析

为确定导致过渡叶特殊状态的形成过程，作者进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）。WGCNA共确定了17个模块。其中，五个模块（greenyellow、magenta、purple、turquoise和yellow）与过渡叶密切关联。两个模块，greenyellow和magenta，与过渡叶特别相关，并包含许多编码蛋白激酶的基因，包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK）、钙依赖性蛋白激酶(CDPK）和富含半胱氨酸的受体样激酶。关键过渡叶片L7可能受到复杂信号相互作用的调节，不仅是光和其他外部刺激，也有内部激素。

文章亮点

作者报道了大白菜抽穗期的转录组图谱，利用24个空间解剖组织，分别代表大白菜内外叶的不同区域。全基因组转录组分析清楚地将内叶组织与外叶组织分离开来。通过对叶片发育和糖代谢关键基因的空间表达分析，确定了关键过渡叶，关键过渡叶是第一批内弯的叶片。关键过渡叶的形成由一个复杂的信号网络控制，不仅包括内部激素和蛋白激酶，还包括外部光和其他刺激。这个发现为揭示抽穗性状的遗传控制提供了新的见解和丰富的资源。研究过程中作者利用生活中常见材料，结合转录组进行分析，思路简单，设计巧妙，值得借鉴学习。

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2022年值得关注的7大技术榜单

2021年利用空间转录组测序技术发文章呈现井喷式增长，其中已正式发表文章有40余篇，而空间转录组学为特色的预印本bioRxiv搜索“空间转录组学（spatial transcriptomics）”一词，获得了500余条结果，其中80余条是在2021年提交的，可以说2021年是空间转录组测序技术应用好文发表突飞猛进的一年。

2016年-2021年空间转录组文章发表趋势和影响因子分布

通过检索空间转录组发表文章的数据分析来看，该技术在2021年中得到广泛应用，并且文章影响因子主要集中在10~20分区间，其占比高达39%，其次在30分以上占比达到30%，由此可见空间转录组测序技术的应用极大提升了文章的质量和档次。

不仅如此，2021年空间转录组测序技术还在物种上有了新的突破，不再局限于人和鼠常见的模式物种，已经开始迈入哺乳动物（猪）、家禽类（鸡）、植物类（拟南芥、云杉、杨树）等新的物种领域，极大拓展其应用范围。

物种空间转录组文献发表统计

2021年空间转录组在不同组织部位上应用也取得一些新进展：比如骨组织一类就有不少文章发表，有头盖骨[PNAS，IF=11.2]、腰骨骼肌[NatureCommunications，IF=14.9]、肩部肌腱[AnnRheum Dis，IF=19.1 ]；生殖器官有子宫内膜[Nat Genet，IF=27.6]、卵巢[NatureBiotechnology，IF=54.9]；泌尿系统：前列腺[Nature Communications，IF=14.9]、膀胱[NatureCommunications，IF=14.9]；肠道组织：胎儿肠道[Cell，IF=41.6]；脂肪组织：皮下腹部[CellMetabolism，IF=27.3]；脑组织：脑内炎症[[Ann Rheum Dis，IF=19.1 ]，IF=24.9]、等皮质和海马[Cell，IF=41.6]、脑神经系统[AnnuRev Neurosci，IF=12.4]、前额叶皮层[Nat Neurosci，IF=24.9]、海马和前额叶皮质[NatureCommunications，IF=14.9]等都组织区域都有不错的研究报道，甚至连取材最困难的皮肤样本都发表重要研究成果：皮肤肉芽肿[Nature Immunology ，IF=25.6]，空间转录组逐渐在更多的组织类型上得到广泛的应用，揭示更深层次空间维度生物学表型。

空间转录组不同组织应用发表文献统计

基于上面数据我们不难看出来前期研究，脑组织空间基因表达探索最为广泛，当然还有心脏组织、肝组织前列腺组织；植物主要集中在花序器官的研究，随着各种组织探索和尝试，基本上空间转录组已经在各种组织中全面开火，不管从技术的前瞻性也好，还是从空间这个维度深度阐释一些生物学现象，弥补了细胞空间位置信息的趋势，空间多组学技术毫无疑问成为引领科学研究的风向标。

后续文章，敬请关注：

2021年度空间转录组动植物四大应用方向：时空图谱篇（发育）、肿瘤篇、疾病机制篇、生物进化篇

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大脑是一个具有精密组织结构的重要器官。对于大脑结构-功能的关系、发育过程中大脑皮层以及退行性神经疾病领域的研究，空间转录组可以揭示更多的信息。单细胞和空间转录组结合可以将关注的细胞类型及亚型√确的锚定到空间位置上，解析不同功能区域与细胞类型及亚型的关联性。

文献一

英文题目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文题目：小鼠大脑神经炎性星形细胞亚型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文献链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

实验材料：脂多糖（LPS）和生理盐水（saline）处理的雄性和雌性小鼠进行scRNA-seq，共捕获79944个星形胶质细胞。3个LPS和saline小鼠大脑组织切片进行空间转录组。

研究背景：星形胶质细胞在感染、急性损伤和慢性神经退行性疾病后发生炎症转变。这种转变是如何受到时间和性别的影响，它在单细胞水平上的异质性，以及亚状态在大脑中的空间位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究结论：在本研究中作者使用细菌细胞壁内毒素脂多糖研究小鼠皮质星形胶质细胞在急性炎症刺激后的转录组变化。发现星形胶质细胞的转录组变化发生在数小时内，随着时间的推移急剧变化。通过对约80000个星形胶质细胞进行单细胞测序，发现炎症引起广谱的反应，亚型星形胶质细胞经历了不同的炎症转变，并具有明确的转录组特征。利用空间转录组学和原位杂交技术将炎症诱导的反应性星形胶质细胞的关键亚状态锚定大脑区域。总之，数据集为分析星形胶质细胞异质性提供了强大的资源，并将有助于理解局部受限反应性星形胶质细胞亚状态的生物学重要性。

图1 DLPFC组织空间转录组学

文献二

英文题目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文题目：小鼠大脑神经炎性星形细胞亚型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文献链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

实验材料：脂多糖（LPS）和生理盐水（saline）处理的雄性和雌性小鼠进行scRNA-seq，共捕获79944个星形胶质细胞。3个LPS和saline小鼠大脑组织切片进行空间转录组。

研究背景：星形胶质细胞在感染、急性损伤和慢性神经退行性疾病后发生炎症转变。这种转变是如何受到时间和性别的影响，它在单细胞水平上的异质性，以及亚状态在大脑中的空间位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究结论：在本研究中作者使用细菌细胞壁内毒素脂多糖研究小鼠皮质星形胶质细胞在急性炎症刺激后的转录组变化。发现星形胶质细胞的转录组变化发生在数小时内，随着时间的推移急剧变化。通过对约80000个星形胶质细胞进行单细胞测序，发现炎症引起广谱的反应，亚型星形胶质细胞经历了不同的炎症转变，并具有明确的转录组特征。利用转空间录组学和原位杂交技术将炎症诱导的反应性星形胶质细胞的关键亚状态锚定大脑区域。总之，数据集为分析星形胶质细胞异质性提供了强大的资源，并将有助于理解局部受限反应性星形胶质细胞亚状态的生物学重要性。

图2 单细胞转录组鉴定星形细胞亚群及空间转录组细胞定位

文献三

英文题目：Molecular atlas of the adult mouse brain

中文题目：成年小鼠脑分子图片

期刊：Science advances

IF：13.116

文献链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32637622

实验材料：三只雄性小鼠（9周龄）的大脑

研究背景：在建立子区域及其边界的参考图以及确定神经元类型及其连接性的多样性方面，对成年大脑进行映射是探索定义动物行为多样性的脑回路的结构与功能关系的核心。实验神经科学依赖于重复准确地记录和操纵特定大脑区域中神经元亚型活动的能力，因此，基因靶向方法已被证明在针对细胞类型的靶向中极为有价值。

研究结论：作者基于全脑范围内ST模式的无监督分类建立了成年小鼠大脑的分子图谱。这种方法是一个在全脑范围内映射离散空间域的无偏方法，并且还利用空间信息开发分子方法以研究神经系统组织，引入了分子和空间代码进化保守性的能力，以及它们与生理学和病理学的关系。另外作者简化了大脑基因索引测试区域分类的能力，这些基因也足以将整个成年大脑映射到相关的子区域。这种方法从分子视角对全脑进行分类绘制图谱，并比较物种间脑区域分布的保守分子标记，可作为关键点为治疗脑部疾病提供新策略。

图3 空间转录组绘制全脑分子图谱

空间转录组在神经学方向研究思路

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