英文题目：Identifification of epilepsy-associated neuronal subtypes and gene expression underlying epileptogenesis
中文题目：鉴定癫痫相关的神经元亚型和诱发癫痫的基因表达
发表时间：2020年10月7号
影响因子：12.121
研究背景
癫痫是一种神经系统疾病，具有自发性和反复发作的特征，其主要发生在海马体或大脑皮层区域。人们对癫痫的病理生理学仍然知之甚少。虽然有一些动物模型研究显示某些神经元亚型对癫痫发作的产生和传播有一定的促进作用，但在人类癫痫患者的相应数据却很少。这是由于癫痫发生过程中复杂的神经网络现象。
实验方法
10x snRNA-seq，Smart-seq2?snRNA-seq，RNA-seq，ISH等
结论
该项研究揭示了癫痫对神经元转录的不同影响—即虽然许多亚型表现出轻微的基因表达变化，但其对一些特定的SUB型主要神经元和GABA能间神经元产生了很大的影响。
结果
一、癫痫皮质中与疾病相关的神经元亚型
为了识别哪些神经元亚型受癫痫影响或导致癫痫，文章中比较了来自癫痫性颞皮质和非癫痫性颞皮质的snRNASeq数据，研究结果表明，在一些位置，例如，皮层上层L2_Cux2_Lamp5和L2-3_Cux2_Frem3，在癫痫和非癫痫的皮层产生的神经元之间存在明显的转录组转移(图1a)。此外，尽管癫痫病和非癫痫病样本中每个亚型的神经元数量大致相似，但观察到几种亚型中已被鉴定的细胞核数量显著减少(图1b)。在癫痫患者中，L2/3亚型的数量减少了，当对每种情况下的序列神经元总数进行归一化时，这种减少更加明显(图1c)。对于中间神经元，Pvalb_Sulf1亚型的神经元数量减少较多(图1c)。
通过基因表达相关性分析，发现癫痫和非癫痫神经亚型之间的巨大差异(图1d)，这可能表明癫痫对其转录组有特定的影响。对于主要神经元，L5-6_Fezf2_Tle4_Abo、L5-6_Themis_Ntng2、L2_
Cux2_Lamp5和L2-3_Cux2_Frem3亚型在癫痫和非癫痫皮质中转录组差异大(图1d)。对于gaba能间神经元，在癫痫发作的颞叶皮层中，Vip_Cbln1、Sst_Tac1、Pvalb_Sulf1、Pvalb_Nos1和Id2_Lamp5_Nos1的转录组改变大。同时也证实了癫痫相关DE基因在具有较大转录组差异的神经元亚型中普遍存在(图1e、f)。
图1癫痫和非癫痫数据集的整合和疾病相关神经元亚型的鉴定
二、共有和亚型特异性癫痫相关途径
作者计算了每种已鉴定亚型GO中DE基因的富集程度，一些神经元亚型在癫痫中表现出了大的转录组改变(>100丰富的GO)，但多数神经元亚型中只有少数GO，特别是对于生物过程(BP)来说，这应该与通路的生物学功能相关(图2a)。这些受影响较小的亚型中，大多数在癫痫细胞和非癫痫细胞之间也具有高的基因表达相关性(图1d)，从而证实癫痫和非癫痫之间转录组相关性高的亚型中，癫痫改变的信号通路也较少。
根据GO分析，发现一些Sst亚型、Vip_Cbln1和Id2_Lamp5亚型显示DO高度富集，如局灶性癫痫(DOID:2234)、癫痫综合征(DOID:1826)和颞叶癫痫(DOID:3328)。此外，还发在L3_Cux2_Prss12、L5-6_Fezf2_Lrrk1_Sema3e和L5-6_Fezf2_Tle4_Abo主要神经元亚型中富集的与癫痫相关的DO相同。这表明，与癫痫相关的DO在不同的神经元亚型中富集差异很大，与谷氨酰胺能细胞相比，在GABAergic和Sst亚型Vip_Cbln1和Id2_Lamp5中，癫痫相关的DO在GABAergic和Sst亚型Vip_Cbln1和Id2_Lamp5中富集更广泛，显示出对癫痫的特殊易感性。
图2神经元亚型中癫痫相关通路和转录转移的鉴定
三、癫痫活动的信号通路
谷氨酸受体，尤其是AMPA受体被证明是癫痫发作的主要驱动力之一，在筛选出缺乏表达的基因后，寻找富含与奋性相关转录组学变化的亚型，并从这些GO项中绘制DE基因（图3a–d）。CKAMP44是贯穿整个颞叶皮质的主要AMPA受体辅助亚基，这一事实也强调了CKAMP44上调的重要性(图3c, d)。癫痫对AMPA受体辅助亚基编码基因的上调有相当普遍的影响。
多种谷氨酸受体亚基和神经元活性相关基因表达复杂失调，其中大部分在癫痫中未见报道。因此,虽然大多数的基因编码谷氨酸受体亚基表达上调(GRIA1、GRIA3 GRIA4, GRIK3, GRIK4, GRIK5, GRIN2B, GRIN3A, GRM1, GRM7,和GRM8),但一些是表达下调(GRIA2、GRIA3 GRIN2A, GRM5, GRIK1,和GRIK2)(图3?b, c)。
图3鉴别可能导致癫痫发作的皮层神经元亚型的信号通路和基因
癫痫患者皮层谷氨酸介导兴奋相关基因显著分层上调或下调。作者用单分子荧光原位杂交(smFISH)方法标记了几个高度调控基因的mRNA。如上所述，在主要神经元的亚型中，编码AMPA辅助亚基的许多基因分层上调。因此，在一组癫痫和非癫痫样本的皮质切片中标记了CKAMP44 mRNA，通过与Rorb和DAPI共标记，并确定了L2/3、L4和L5/6的位置(图4b)。重要的是，证实了各层中CKAMP44的表达显著上调(图4b)。
图4癫痫患者皮层谷氨酸介导兴奋相关基因的复杂分层失调
四、受癫痫影响的基因网络
在癫痫样本中，六个与癫痫密切相关的模块上调，六个下调。另外，在细胞水平分析中突出的几个涉及过度兴奋信号和癫痫发作的基因也是一个或多个癫痫相关基因模块的成员。编码谷氨酸受体亚基的基因也广泛存在于癫痫相关模块中。这些基因共表达分析捕获了主要神经元L5-6_Fezf2_Tle4_Abo和L2-3_Cux2亚型中活跃的核心转录网络。与癫痫状态相关的基因模块指向与突触和离子通道相关的转录变化，包括AMPA受体辅助亚基、谷氨酸受体亚基和电压门控钠通道，这些可能与癫痫回路异常高的兴奋有关。同时观察到主要神经元和GABAergic间神经元的受影响的亚型根据丰富的GO项的相似性聚集在一起(图5b)。因此，L2-3_Cux2和L5-6_Fezf2亚型与Sst_Tac1和Vip_Cbln1亚型共聚，而L3_Cux2_Prss12亚型与Pvalb_Sulf1亚型共聚，这可能是癫痫转录组中受影响严重的局部神经网络的基础。
图5综合分析癫痫易受影响的神经元亚型
结论
总之，该研究通过单核转录组测序（snRNA-seq）发现癫痫患者的神经转录组发生了大规模而复杂的变化，其中一些亚型表现出了明显的癫痫驱动的基因表达异常，而其他亚型则大部分未受影响。癫痫相关的转录组改变可以聚集成包含多个神经元亚型的模块，这些神经元亚型可能是受癫痫影响的不同神经元聚集的基础。未来需要在小鼠模型和人类组织中进行转化研究，以解决哪些已确定的通路导致癫痫的产生和传播，以及哪些更能代表神经网络的稳态可塑性。
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本次我们给大家带来两篇利用单细胞转录组技术助力动物细胞图谱绘制的高分文章解读，希望能给老师后续的研究提供思路。
动物细胞图谱分析绘制案例：黑腹果蝇
中文标题：果蝇细胞图谱：成年果蝇的单核转录组图谱
英文标题：Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly
期刊：Science[IF: 63.714] 2022.3.4
DOI：10.1126/science.abk2432
实验设计
实验材料：黑腹果蝇
实验方法：解剖了来自雌性和雄性黑腹果蝇的12个组织（触角、体壁、脂肪体、平衡棒、心脏、肠道、腿、马氏管、绛色细胞、喙和下颚须、气管、翅膀）以及3个性别特异性组织（雄性生殖腺、睾丸、卵巢）。对于遍布全身的组织使用特异性GAL4驱动核-GFP蛋白，再用流式细胞荧光分选技术标记和收集细胞核，进行单细胞核snRNA-seq
测序策略：单细胞核转录组10x Genomics、Smart-seq2
研究内容
黑腹果蝇在生物学研究方面有着丰富的历史，以往研究探索了其不同组织中的表达模式，但缺乏细胞类型分辨率级别的数据库。近年来单细胞技术的进步使得同时对数千个细胞进行转录组分析成为可能，促进了全组织细胞图谱的创建。然而，现有scRNA-seq数据集来自不同实验室，是基于不同遗传背景，不同分离方法以及不同测序平台产生的，阻碍了跨细胞和组织的基因表达的系统性分析。
该研究通过对果蝇多组织进行单细胞核转录组测序后，得到了果蝇细胞图谱。之后对15个组织进行详细的细胞注释，在果蝇头部，注释到了81种主要的神经细胞类型，在果蝇的躯体中注释了最丰富的33种细胞类型。该图谱还可用于进行相同细胞的跨组织分析，作者通过分析血细胞在整个组织中的表达情况，发现了血细胞中最常见的细胞类型——浆细胞，并未在成虫血细胞中观察到叶状血细胞。通过对肌肉细胞在不同组织类型进行比较，发现它们主要在果蝇躯体、体壁和腿部有特定的富集，并发现内脏肌、骨骼肌、间接飞行肌的分离。
通过转录因子分析，找到了500个转录因子和细胞类型具有高特异性，绘制了每种细胞类型中特异转录因子的表达热图。此外，作者还使用SCENIC预测了基于共表达和motif富集的基因调控网络。通过对广泛细胞类型或组织的基因进行比较分析，发现了在各种细胞类型中的常见表达基因和特定表达基因。
通过对性别依赖的基因表达和性别特异性组织分析，发现体细胞中的主要性别决定基因doublesex（dsx）的表达在很大程度上不具有性别特异性，而许多其他基因的表达具有性别依赖。作者进一步对精母细胞和精细胞进行轨迹推断，发现精母细胞期被转录的基因数量持续增加，许多强烈上调的基因在任何其他细胞类型中都没有基本表达。然而，晚期精母细胞显示了来自许多其他细胞类型的标记基因的表达。
果蝇细胞图谱：成年果蝇的单核转录组图谱
动物细胞图谱分析绘制案例：食蟹猴
中文标题：食蟹猴单细胞转录组和调控组参考图谱
英文标题：A reference single-cell regulomic and transcriptomic map of cynomolgus monkeys
期刊：Nature comuiations?[IF: 17.694]?2022.07.13
DOI：10.1038/s41467-022-31770-x
实验设计
实验材料：成年食蟹猴
实验方法：选取16个器官（心、肝、脾、肺、肾、胃、结肠、肌肉、气管、主动脉、脂肪、膀胱、舌头、乳腺、子宫和睾丸）
测序策略：10x Genomics单细胞转录组测序（scRNA-seq）和单细胞染色质开放性测序（scATAC-seq）
研究内容
非人类灵长类动物（Non-human primates）在系统发育上与人类非常接近，在遗传、器官发育、生理功能、病理反应和生化代谢等诸多方面表现出与人类相似的特征，是生物医学研究和药物开发的理想实验动物模型。其中，最为典型的代表当属食蟹猴。系统评估食蟹猴等非人灵长类动物模型与人类的细胞组成差异、器官异质性和基因表达时空特异性等在基础研究中具有十分重要的价值。
该研究对成年食蟹猴的16个代表性器官进行单细胞转录组测序和单细胞染色质开放性测序，构建了食蟹猴多器官的单细胞多组学参考图谱，将25万个细胞进行 t-SNE降维聚类得到40余种不同的细胞亚群。
通过对该细胞图谱进行分析，鉴定到了新的细胞类型。为了解析上皮细胞异质性，作者提取上皮细胞并进行亚群聚类分析。根据marker基因的独特表达模式，分析鉴定出14个上皮细胞簇，包括基底细胞、分泌细胞、纤毛细胞和非纤毛细胞。纤毛上皮细胞在各种组织中都占很大比例，为了探索纤毛上皮细胞亚型的发育和功能动态，作者选用纤毛上皮细胞相对较多的器官，使用Monocle和RNA速度分析对纤毛上皮细胞进行轨迹分析，观察到纤毛细胞从祖细胞状态向成熟状态分化的过程，沿着拟时间高表达的基因在与代谢过程、细胞对刺激的反应和防御反应相关的基因本体(GO)术语中顺序富集。
使用CellPhoneDB细胞通讯分析，发现基质细胞、上皮细胞和髓系细胞之间存在强烈的细胞间相互作用。通常，细胞间相互作用的强度和模式是器官特异性的。为了重新绘制调节细胞-细胞相互作用的分子相互作用，作者在不同器官的特定细胞亚群中绘制了配体-受体对，揭示了猴子各种器官细胞间通信的潜在分子机制。
结合表达谱和染色质开放性数据，作者分析预测了控制不同细胞类型基因表达模式的关键调控子。发现SPIB、POU2F2、SPI1、CEBPD和IRF4是髓系细胞中的关键调控子；而FEV具有调节造血干细胞的潜能，该转录因子广泛参与对免疫细胞和上皮细胞的基因表达调控。大多数顺式调控元件(CREs或ATAC峰)来自启动子、内含子或远端基因间调控区。在scATAC-seq数据中预测了9种细胞类型，在RNA簇中发现了两种罕见的细胞类型，单核细胞和循环B细胞，但在ATAC簇中没有发现。总之，本文中的scATAC-seq数据为无偏见地发现食蟹猴的细胞类型和调控DNA元件提供了丰富的资源。
最后，作者进行了跨物种比较分析，通过整合分析器官匹配的单细胞转录组数据，探讨了人、食蟹猴和小鼠三个物种之间的细胞组成和基因表达特异性。猴子和人类在同源基因表达方面表现出明显高于其他比较的细胞类型相似性。其中，免疫细胞相较于非免疫细胞，人类和猴子之间的基因表达具有更高的相似性。间质细胞在人鼠和猴鼠比较中表现出最高的相似性。这些发现表明，猴子在免疫系统中与人类具有高度相似的转录程序，因此可能为研究对癌症或新冠病毒COVID-19等疾病的免疫反应提供理想的模型。
食蟹猴多器官单细胞多组学参考图谱构建与分析
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