英文名:?Integration of full-length transcriptomics and?targeted metabolomics to identify?benzylisoquinoline alkaloid biosynthetic genes in?Corydalis yanhusuo
杂志：Horticulture Research
影响因子：5.404
研究背景
延胡索( Corydalis yanhusuo W.T. Wang) ，别名元胡，罂粟科紫堇属多年生草本植物，常以其干燥块茎入药，是世界上具有低成瘾性和耐受性的镇痛中药，镇痛效价约为吗啡的60%。四氢巴马汀和左旋紫堇达明已被确认为延胡索中具有镇痛活性成分，可作为阿片类镇痛药的替代品，但含量低下，产量较小的缺点制约着该类药物的应用。
研究目的
对合成原小檗碱型苄基异喹啉生物碱的相关基因进行了挖掘，为后期利用合成生物学与植物代谢工程生产延胡索中具有镇痛效果的痕量化合物奠定了基础。
材料方法
延胡索，成熟期的叶和块茎，道地产区浙江磐安
代谢：UPLC-Q-TOFMS定性定量
转录组：二代+三代全长转录组测序
研究结果
1、转录组和代谢组测序分析
该研究以来自道地产区浙江磐安的延胡索成熟期的叶和块茎为研究对象，采用UPLC-Q-TOFMS定性定量分析了延胡索中具有镇痛活性的成分，并通过二代校准的三代全长转录组测序的方法对合成原小檗碱型苄基异喹啉生物碱的相关基因进行了挖掘。
延胡索提取物的块茎和叶组QTOF-MS数据的代谢组学多元分析
延胡索块茎和叶片之间基因的差异表达
2.、转录组-代谢组联合分析
对处于不同器官的组织样品进行了转录组-代谢组联合分析，最终鉴定到了101个参与苄基异喹啉生物碱(benzylisoquinoline alkaloid,BIA)生物合成途径的unigenes和38种在延胡索叶与块茎中含量具有显著差异的代谢物，并对其中19种典型的代谢物进行了器官差异性丰度测定。结果显示，目前已知的合成途径在延胡索中报导过的BIAs合成途径中均成功对应到至少一种关键合成酶的unigene，说明BIA的空间分布差异主要受到转录水平上的调控。
苄基异喹啉生物合成途径
3、 OMT蛋白家族系统发育树分析
进一步研究发现，其中参与合成具有广泛临床镇痛潜力的关键代谢物四氢巴马汀的酶可能与唯一已知的黄连中负责催化这一步反应的ColumbamineO-methyltransferase(CoOMT)存在较大的蛋白质序列差异。通过系统发生树分析，作者们推断出至少存在10种unigenes的翻译产物可能催化四氢巴马汀的合成。 特异性的氧甲基化是四氢巴马汀与紫堇达明合成的关键，延胡索中是否存在特殊的一类OMT或者具有不同底物特异性的OMT则是接下来将要重点解析的重点。
OMT蛋白家族系统发育树
文章亮点
本研究明确了镇痛成分的生物合成机制，同时为进一步生化水平上的活性验证提供了方向，且为后期延胡索功能基因组的解析奠定基础。
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]]>食品是非常复杂的基质，含有数千种成分，是动植物代谢的结果。食品成分在加工前、加工过程中和加工后都受到外部因素的影响。食品品质已成为肉品行业的主要关注点之前。对质量的评估包括香气、风味、营养和色泽等多个方面，需要通过不同的方法来进行评估，使得方法及其复杂。而基于质谱的代谢组学方法信息丰富，可以获取代谢物的信息，将其特性和食品品质关联一起，为解决这复杂问题提供了支撑。
01、辐照对绞肉代谢组学特征的影响及其对食品安全的影响
辐照是一种高效灭菌方法，对肉类保存具有重要作用。本研究基于定性非靶向?HPLC-Orbitrap?代谢组学方法，旨在估计辐照鸡肉、火鸡和混合（鸡肉、火鸡和猪肉）绞肉的全局代谢组谱变化，以评估可能存在的食品安全关于代谢组改变的问题。通过LC-MS共鉴定了?402?种代谢物，并且所有三种基质都表现出特定的代谢组谱，该谱组不受应用五种不同辐照强度水平的显着影响。特别是，所有三个肉类类别都显示出以下共同特征：
1)?游离氨基酸库不受辐射影响
2)?牛磺酸似乎是所有三类*重要的区别因素
3)?谷胱甘肽的含量减少
4)?发生轻微的多不饱和游离脂肪酸的氧化修饰
5)?强化的腺苷核苷酸降解。所提出的分析方法强调了肉类代谢组分析在区分辐照肉类和未处理肉类方面的有用性。
02、动物友好型饲养环境对鸡大腿肉品质、储存稳定性和代谢组学特征的影响
本研究使用基于核磁共振的代谢分析，调查了合法批准的动物友好型饲养环境对鸡大腿肌肉理化质量和储存稳定性的影响。一天大的?Cobb?小鸡在室内系统中的常规或动物友好型农场饲养?35?天。将来自传统农场?(CB)?的鸡大腿肉和来自合法批准的动物友好型农场?(AFB)?的鸡大腿肉储存?7?天，并分析肉类的代谢组学特征和特征。基于它们的代谢组学特征，通过偏最小二乘判别分析清楚地分开了两组鸡。糖酵解相关产物（葡萄糖和乳酸）在?AFB?中更丰富，而肌苷、次黄嘌呤和游离氨基酸在?CB?中的含量更高。动物友好的饲养环境导致AFB的代谢途径和理化质量的差异调节，与CB相比，其pH和持水能力较低，剪切力较高。然而，两组鸡在微生物质量、脂质氧化、挥发性碱性氮和脂肪酸谱方面都保持了储存稳定性。这些结果表明，动物友好的饲养环境可能通过代谢变化导致肉质的差异。
03、基于质谱的代谢组学揭示添加中链单酸甘油酯对鸡肉的改善作用：味道、鲜肉质量和成分
本研究旨在揭示中链甘油单酯?(MG)?补充剂引起的鸡肉鲜肉质量、成分和味道的差异。结果表明，添加?MG?可改善鸡汤和肉味。上调升-carnosine，肌氨酸，尿苷和促成了鲜味和肉味的MG组的鸡汤烟酰胺。膳食MG增加了鸡胸肉肌肉中的总超氧化物歧化酶活性和氨基酸含量，并降低了丙二醛含量和滴水损失。此外，肉类代谢组显示肌酸、甜菜碱、l-鹅肌氨酸、肌苷?5′-单磷酸、次黄嘌呤、肌苷和磷脂，以及氨基酸和嘌呤代谢途径，与通过添加?MG?改善肉鸡的肉质、成分和味道有关。总之，这些发现提供了证据，证明添加?MG?可以改善肉鸡的鲜肉质量、成分和味道。
04、基于?LC-MS?的代谢组学揭示了山羊肉辐照过程中代谢物的动态变化
本研究应用LC-MS非靶向代谢组学方法来鉴定辐照山羊肉的化学成分，并研究辐照对其代谢特征的影响和肉质。共有?103?种代谢物被确定为负责辐照山羊肉代谢变化的差异代谢物，它们参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢和嘌呤代谢。包括氨基酸、核苷酸及其衍生物的差异代谢物被确定为辐照过程中肉质的鉴别因素。具体而言，L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、鸟苷、鸟嘌呤、肌酐、谷胱甘肽和烟酸增加，而肌苷?5′-单磷酸?(IMP)?和鸟苷?5′-单磷酸?(GMP)?减少。总体而言，除?L-苯丙氨酸和鸟嘌呤外，其他相关代谢物均随储存显着减少。本研究有助于从分子水平全面了解辐照剂量和贮藏时间对山羊肉代谢的影响，从而评价辐照山羊肉的质量。线性度令人满意的结果?(R2??>?0.995)、精密度（RSD小于8.9%）和回收率（83%-106%），表明非靶向代谢组学方法适用于监测辐照山羊肉中小分子代谢物的变化，辐照是可行的山羊肉的保鲜方法。
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参考文献：
[1]?Sara?Panseri,et?al.Impact?of?irradiation?on?metabolomics?profile?of?ground?meat?and?its?implications?toward?food?safety,LWT,2022,113305,ISSN0023-6438,https://doi.org/10.1016/j.lwt.2022.113305.
[2]Tao,?Lad?,?et?al.?“Mass?spectrometry-based?metabolomics?to?reveal?chicken?meat?improvements?by?medium-chain?monoglycerides?supplementation:?taste,?fresh?meat?quality,?and?composition.”?Food?Chemistry?(2021).
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[4]Wang?Jia,?et?al.?LC-MS-based?metabolomics?reveals?metabolite?dynamic?changes?during?irradiation?of?goat?meat，Food?Research?International，Volume?150,?Part?A,?December?2021,?110721
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背景介绍
在NAFLD患者体中，经常发现血浆中氨基酸的浓度增加，特别是支链氨基酸。然而，这一现象也可能是由于肌肉蛋白质分解增加，肥胖和/或胰岛素抵抗（IR）增加或是由于受损的组织代谢导致，其具体机制尚未可知。
发表在Hepatology（IF=14.079）上的Altered amino acid concentrations in NAFLD: impact of obesity and insulin resistance?通过一组代谢组数据和病理数据发现：氨基酸血浆浓度的增加主要在肥胖的NAFLD受试者中出现，这可能是胰岛素抵抗（IR）和蛋白质分解代谢增加的结果。
实验设置
44例非糖尿病的NAFLD患者（29例非肥胖，15例肥胖），20例健康人（CT）。禁食过夜后收集血样以测量肝酶活，脂质含量，葡萄糖浓度，游离脂肪酸含量，胰岛素抵抗，氨基酸含量。
结果
1.?研究对象的临床特征
使用GC-MS检测血浆中氨基酸含量，NAFLD患者血浆中异亮氨酸和缬氨酸（支链氨基酸），酪氨酸（芳香族氨基酸），丙氨酸，赖氨酸和谷氨酸含量较高，而血浆甘氨酸浓度显着下降。大部分患者的BMI小于30 kg/m2，然而，大多数氨基酸仅在NAFLD-Ob（肥胖的NAFLD患者）中增加。与CT相比，NAFLD-NO（非肥胖的NAFLD患者）中只有丙氨酸、谷氨酸、异亮氨酸和缬氨酸浓度增加。另外，患者有更高的肝酶活（ALT、GGT、AST）。
表1 血浆氨基酸浓度
2.?GSG指数
这些氨基酸以某种方式参与合成谷胱甘肽（GSH）和脂毒性相关的脂质前体。 因此，我们测试了GSG指数与肝脏组织学改变的相关性，其中GSG-index指数计算了[Glutamate/(Serine+Glycine)]。
我们发现与CT相比，NAFLD患者的谷氨酸浓度明显更高，甘氨酸浓度更低。?与CT相比，NAFLD-NO中的GSG指数更高，而NAFLD-Ob中更高。?由于转氨基作用， GSG指数与肝酶活紧密相关，尤其是和γ-谷氨酰转移酶GGT紧密相关。GSG指数也和支链氨基酸相关，尤其是亮氨酸，说明谷氨酸脱氢酶作用增加。单独的谷氨酸也以较弱的方式与肝功能试验（LFTs）相关，而LFTs与构成GSG指数的其他氨基酸（甘氨酸或丝氨酸）的浓度之间未发现相关性。
?图1 GSG指数与肝酶活相关性
3.?氨基酸和胰岛素抵抗IR
肝胰岛素抵抗（Hepatic-IR）反映胰岛素不能抑制空腹内源性葡萄糖生，HOMA-IR能同时反映肝脏和外周的胰岛素抵抗。我们检测肥胖与非肥胖NAFLD的IR程度是否不同，以及与CT相比，肥胖与非肥胖NAFLD的氨基酸浓度有何不同。
只有少数氨基酸与Hep-IR显着相关。 甘氨酸和组氨酸与Hep-IR具有显着的负相关。而谷氨酸和酪氨酸与Hep-IR发现正相关，只有酪氨酸与HOMA IR相关。外周胰岛素敏感性仅与酪氨酸相关。GSG指数与Hep-IR相关，稍微与HOMA-IR相关，但与外周胰岛素敏感性无关。 芳香族氨基酸与Hep-IR，HOMA-IR和外周胰岛素敏感性相关，但仅仅因为酪氨酸。通过使用多变量分析，我们评估了BCAA，AAA和GSG指数中哪些与Hep-IR和HOMA-IR独立相关，并发现GSG指数和AAA与Hep-IR独立相关，而只有AAA与HOMA-IR独立相关。
4.?氨基酸作为肝脏炎症和纤维化的标志物
我们首先检测肝脏炎症和气球样变时哪些氨基酸的浓度改变。相比于对照组，气球样变2级的患者血浆中BCAA、AAA、谷氨酸，丙氨酸和赖氨酸含量增加，而甘氨酸和苏氨酸浓度下降。 氨基酸浓度也与肝纤维化增加有关，但在纤维化评分为3和4的NAFLD中观察到的浓度与纤维化评分为0-2的患者没有显着差异。
用于计算GSG指数的氨基酸在某种程度上参与GSH的合成和脂毒性相关的脂质前体合成。因此，我们测试了GSG指数是否与肝脏组织学的改变相关。患有NAFLD的受试者具有更高的GSG指数，而与肝脏活组织检查中存在的气球样或炎症无关。GSG指数随肝纤维化程度显着增加，特别是F3-4严重纤维化。
图2 不同肝气球样变程度中氨基酸含量
小结
本文选取对照组、肥胖患病组、非肥胖患病组，通过代谢组检测血浆中氨基酸含量，并结合临床病理数据，建立了GSG指数模型，更加准确的检测NAFLD患者肝病程度，并且排除肥胖等因素的干扰。结果表明：AA血浆浓度的增加主要在肥胖的NAFLD受试者中出现，这可能是IR和蛋白质分解代谢增加的结果。GSG指数可以作为肝脏疾病严重程度的新标志物。
代谢物是疾病发展的直观体现，通过代谢组检测能够更加直接有效的揭示体内变化情况。目前氨基酸高通量靶标代谢组、游离脂肪酸高通量靶标代谢组、短链脂肪酸高通量靶标代谢组、胆汁酸高通量靶标代谢组、脂质代谢组在医学研究中有广泛应用。大量的文章也会将转录组、微生物多样性与代谢组关联分析，深入阐释疾病发生发展的机制，为基础研究、临床诊断提供新的研究思路。
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对缺失值的处理，简单粗暴的方法是直接去除所有含有缺失的代谢物，对于一些代谢物如果是在样本中大量缺失（比如超过了50%）确实可以舍弃，而少量缺失如果丢弃则可能会丢失一些有重要生物学意义的代谢物，所以对于少量缺失，较为稳妥的办法就是用值填补。比较简单的方法是用0值、均值、中值或最小值的一半进行填补，复杂一点的则是使用机器学习的算法如邻近算法（KNN）、随机森林（RF）、奇异值分解（SVD）等方法。由于代谢组目前可分为靶向和非靶向两大类型，在不同的类型中往往是采取不同的处理办法。有研究者认为非靶向的推荐使用KNN算法（Do et al.,2018）；也有认为GC-MS数据使用随机森林方法（Gromski et al.,2014）；还有的则认为需要按缺失类型，对于完全非随机缺失的可使用最小值的一半进行填补，完全随机缺失或随机缺失的使用随机森林方法（Wei et al.,2018）。所以目前没有统一的标准。
标准化主要是为了去除实验、技术等带来的误差，常见的方法有：内标，即代谢物除以内标丰度，可用于GC-MS；总峰面积标准化，即代谢物除以所有代谢物的总峰面积，可用于非靶向LC-MS；对数变换即直接对丰度取对数，LC-MS和GC-MS都有用到；PQN （Probabilistic Quotient Normalization）即每个代谢物除以了一个稀释因子，这个因子则是依赖于样本与参考样本比值的分布，在NMR分析中被认为是一种稳健的方法；此外还有均值标准化、分位数标准化、中值标准化、z-score标准化等（Li et al.,2017），这些方法也可以结合使用（Di et al.,2016）。不同方法可能会引起不同分析目的的差异，比如进行差异分析的时候，使用分位数方法可能比PQN方法好，而在进行代谢标志物筛选时，则表现差不多（Li et al.,2017）。因此，在分析的时候也可多尝试一些标准化的方法。
总的来说，缺失值和标准化的处理方法目前并无完全统一的标准，需要结合具体的实验方法、目的进行多次的调试以达到所期望的目标。目前，百迈客云上的代谢组分析平台已包含上述部分处理方法，操作简单，分析速度快，后续也会不断增加更多的处理方式以满足不同需求。
参考文献：
[1]?Do K T, Wahl S, Raffler J, et al. Characterization of missing values in untargeted MS-based metabolomics data and evaluation of missing data handling strategies[J]. Metabolomics, 2018, 14(10): 128.
[2] Gromski P, Xu Y, Kotze H, et al. Influence of missing values substitutes on multivariate analysis of metabolomics data[J]. Metabolites, 2014, 4(2): 433-452.
[3] Wei R, Wang J, Su M, et al. Missing value imputation approach for mass spectrometry-based metabolomics data[J]. Scientific reports, 2018, 8(1): 663.
[4]?Di Guida R, Engel J, Allwood J W, et al. Non-targeted UHPLC-MS metabolomic data processing methods: a comparative investigation of normalisation, missing value imputation, transformation and scaling[J]. Metabolomics, 2016, 12(5): 93.
[5]?Li B, Tang J, Yang Q, et al. NOREVA: normalization and evaluation of MS-based metabolomics data[J]. Nucleic acids research, 2017, 45(W1): W162-W170.
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